Kromatografi Kolom Terbuka

Kromatografi kolom adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen pada sampel.

PRINSIP KROMATOGRAFI KOLOM

Komponen-komponen dalam zat contoh yang harus diperiksa mempunyai afinitas yang berbeda-beda terhadap adsorben dalam kolom. Apabila eluen dialirkan secara kontinyu melalui kolom yang berisi zat contoh yang telah diadsorbsi oleh adsorben, maka komponen yang pertama keluar adalah komponen yang paling lemah terikat pada adsorben. Komponen lainnya akan keluar sesuai dengan urutan afinitasnya terhadap adsorben sehingga terjadi pemisahan komponen-komponen tersebut.

Gambaran tentang kromatografi kolom terbuka dapat dilihat pada video di bawah ini!

PENYIAPAN ADSORBEN DAN ELUEN

Adsorben yang akan digunakan pada kromatografi kolom harus memenuhi syarat sebagai berikut:

1.         Tidak larut dalam eluen yang digunakan

2.         Inert, tidak bereaksi dengan sampel

3.         Cukup aktif sehingga mampu mengadsorpsi sekaligus memungkinkan perambatan sel

4.         Memungkinkan aliran yang baik dari eluen

5.         Reprodusibel, dapat diproduksi dengan sifat yang konstan

Mekanisme pemisahan pada kromatografi kolom umumnya terjadi karena adsorpsi sehingga sebelum adsorben dibuat menjadi bubur, serbuk adsorben harus diaktifkan terlebih dahulu dengan pemanasan. Suhu dan lama waktu pemanasan menentukan derajat keaktifan. Tujuan pengaktifan ini sama dengan pengaktifan lapisan adsorben pada KLT. Sifat adsorben terutama tergantung pada pH dan derajat keaktifannya. Berdasarkan aktivitas adsorpsi relatif terhadap alumina, disusun suatu tingkat aktivitas Brockmann, sehingga adsorben digolongkan ke dalam golongan I hingga V.

Gugus polar pada permukaan alumina dan silika, terutama gugus hidroksi akan menarik molekul komponen sampel melalui interaksi dipol-dipol dan ikatan hidrogen. Jika titik-titik tersebut diduduki air atau pelarut berproton seperti alkohol dan amina, maka permukaan tidak dapat berfungsi lagi sebagai adsorben dan dikatakan menjadi non aktif. Selain itu, afinitas adsorben dapat dimodifikasi secara kimia dengan penambahan asam.

Berdasarkan sifatnya, adsorben tertentu dapat berperan sebagai katalisator sehingga dapat menyebabkan terjadinya reaksi dengan komponen sampel. Alumina basa merupakan salah satu adsorben yang lingkup penggunaannya paling luas, namun dapat menyebabkan perubahan kimia dan menimbulkan reaksi seperti kondensasi aldehid dan keton. Oleh karena itu, tidak dianjurkan menggunakan aseton sebagai eluen jika adsorben yang digunakan adalah alumina basa, karena akan terkondensasi menjadi diaseton alkohol. Alumina basa dapat dimodifikasi menjadi bentuk asam menggunakan asam klorida, atau dapat juga dimodifikasi dalam bentuk netral menggunakan asam nitrat. Alumina dengan derajat keaktifan I dapat diperoleh dengan pemanasan pada suhu 380-400 ^oC selama 3 jam.

Silika gel dapat digunakan secara luas dengan berbagai eluen. Namun silika gel dapat menyebabkan isomerisasi senyawa tertentu seperti terpen dan sterol. Silika gel dengan keaktifan I dapat diperoleh dengan pemanasan pada suhu 150-160 ^oC selama 3-4 jam.

Adsorben dipilih sesuai dengan polaritas sampel. Adsorben yang digunakan adalah adsorben yang memiliki polaritas sama dengan komponen sampel yang hendak dipisahkan, sedangkan eluen sebaliknya.

Pemilihan pertama dari eluen adalah bagaimana sifat kelarutannya. Kekuatan zat elusi adalah daya adsorpsi pada adsorben dalam kolom. Umumnya pada adsorben polar seperti alumina dan silika gel, kekuatan adsorpsi akan naik seiring dengan kenaikan polaritas zat yang diserap.

Kekuatan elusi dari eluen pada karbon aktif dalam kolom untuk asam amino dan disakarida diturunkan dalam urutan : etil asetat < dietil eter < propanol < aseton < etanol < metanol < air.

Sedangkan untuk alumina dan silika gel urutannya adalah : air < metanol < etanol < propanol < aseton <etil asetat < dietil eter < kloroform <metilen klorida < benzena < toluena <trikloroetilen < karbon tetraklorida < sikloheksana < heksana.

Kemurnian pelarut yang akan digunakan harus setinggi mungkin. Berikut ini adalah tabel adsorben dan eluen yang dapat digunakan pada kromatografi kolom.

PENYIAPAN DAN PENGISIAN KOLOM

Kolom kromatografi dapat berupa pipa gelas, logam, atau plastik, namun umumnya berupa tabung gelas yang dilengkapi dengan kran pada bagian bawah dan plat penyaring di dalamnya. Dalam kondisi tertentu buret juga dapat digunakan sebagai kolom. Ukuran kolom sangat beragam, umumnya memiliki panjang minimal 10 kali diameter dalam.

Adsorben dapat dikemas dalam kolom dengan cara kering maupun basah.

1.         Cara Kering

• Sedikit pasir/glasswoll/penahan adsorben yang lain diletakkan ke dalam kolom
•  Adsorben dituang sedikit demi sedikit. Setiap kali setelah penambahan adsorben, permukaan diratakan dan dimampatkan dengan alat pemampat.
• Jika semua adsorben telah dimasukkan, di permukaan atas diletakkan kertas saring dan ditambahkan sedikit pasir lagi untuk menjaga kerataan permukaan adsorben jika eluen dialirkan.
• Eluen dialirkan dari atas kolom dengan kran kolom terbuka sehingga memungkinkan eluen meresap hingga ujung akhir kolom.
• Setelah eluen mencapai ±1 cm di atas permukaan adsorben, maka kran ditutup dan aliran eluen dihentikan.

2.         Cara Basah

•  Adsorben dicampur dengan eluen untuk dibuat bubur terlebih dahulu.
•  Bubur adsorben dimasukkan ke dalam kolom yang telah berisi eluen ±1/3 panjang kolom
• Selama adsorben turun perlahan, kolom diketuk-ketuk pada semua sisi secara perlahan-lahan dengan ball pipet karet atau bahan lain yang tidak keras. Hal ini dilakukan agar partikel-partikel adsorben dapat menyusun diri dengan kerapatan yang sama sehingga diperoleh lapisan yang homogen
• Selain itu, cara basah juga dapat dilakukan dengan cara:
• Kolom diisi eluen ±1/2 panjang kolom
•  Adsorben kering dimasukkan ke dalam kolom melalui corong dengan aliran teratur
•  Kran dapat dibuka maupun ditutup selama pengemasan asal adsorben yang dimasukkan ke dalam kolom tidak boleh ada bagian yang kering, harus selalu terendam eluen
• Sepotong kertas saring dan selapis pasir diletakkan di atas adsorben untuk menjaga kerataan permukaan adsorben

Partikel-partikel adsorben harus mengisi kolom dengan kerapatan yang sama atau homogen sebab pengisian kolom yang tidak teratur dapat merusak batas-batas pita kromatografi. Selain itu pengisian yang tidak homogen dapat pula disebabkan oleh adanya gelembung-gelembung udara saat pengisian. Oleh karena itu saat pembuatan bubur, adsorben harus diaduk-aduk dan dicuci secara berulang dengan eluen untuk menghilangkan gelembung udara.

PENANGANAN SAMPEL

Kolom digunakan untuk memisahkan campuran dari dua senyawa dengan membuat larutan jenuh dari campuran menggunakan pelarut yang lebih disukai kolom. Berikut ini tahapan penggunaan kolom pada kromatografi kolom:

1.        Pastikan kolom berada dalam posisi tegak lurus

2.     Membuka kran penutup untuk membiarkan pelarut yang sudah berada dalam kolom mengering sehingga material terpadatkan rata pada bagian atas

3.         Menutup kran penutup

4.     Menambahkan larutan sampel secara hati-hati dari bagian atas kolom, harus dicegah terjadinya pengguncangan kolom karena hal tersebut dapat merusak pita. Sampel dimasukkan ke dalam kolom menggunakan pipet tetes melalui dinding kolom sedikit di atas permukaan adsorben. Ujung pipet jangan sampai menyentuh alkohol

5.         Saat sampel dikeluarkan dari pipet, ujung pipet digerakkan melingkar/berkeliling dinding kolom

6.         Kran dibuka agar sampel diserap pada bagian atas adsorben

7.       Tambahkan eluen melalui bagian atas kolom dengan hati-hati saat hampir seluruh sampel terserap ke dalam adsorben

8.         Kran dibuka agar pelarut dapat mengalir melalui kolom

9.    Baik eluen maupun komponen yang terpisah ditampung ke dalam wadah-wadah yang sudah disediakan (beaker gelas, wadah sampel, tabung reaksi, dll)

10.  Pelarut dibiarkan mengalir kontinyu, sehingga tetap ditambahkan pelarut baru dari bagian atas kolom sehingga kolom tidak pernah kering

Gambar 1. Rangkaian alat kromatografi kolom terbuka

MEKANISME PEMISAHAN (ELUSI)

Proses terbawanya sampel dari puncak kolom sampai akhir kolom hingga memisah menjadi komponen-komponennya disebut elusi. Pemisahan terjadi karena komponen sampel lebih banyak tertahan oleh adsorben atau dibawa oleh eluen, tergantung dari afinitas komponen tersebut terhadap kedua fase.

Pada umumnya, lebih lambat jalannya sampel dalam kolom, maka akan diperoleh pita-pita kromatografi yang lebih tegas. Elusi dilanjutkan hingga komponen yang dikehendaki telah terpisah dan keluar dari kolom, yang kemudian ditampung dalam beberapa fraksi pada interval waktu penampungan tertentu.

Elusi dapat dilakukan secara isokratik maupun gradien:

1.         Elusi isokratik

Pada elusi isokratik, eluen yang digunakan selama elusi selalu sama (1 jenis eluen). Elusi digunakan dari awal proses kromatografi kolom hingga diperoleh komponen-komponen yang terpisah.

2.         Elusi gradien

Elusi yang digunakan lebih dari 1 jenis eluen. Pada saat proses elusi, dapat dilakukan penggantian eluen. Jika komponen yang dikehendaki telah terpisah dari campuran, namun masih ada komponen lain yang belum terpisah (sulit terpisah dengan eluen yang mula-mula digunakan), maka eluen dapat diganti untuk mengeluarkan komponen tersebut dengan cara menambahkan eluen baru ke dalam kolom.

Setelah sampel dituang pada puncak kolom, dengan segera sampel akan terdistribusi di antara kedua fase pada puncak kolom. Dengan adanya aliran eluen, maka eluen yang mengandung sebagian sampel akan terdesak ke bagian bawah kolom sehingga akan terjadi distribusi antara eluen dan adsorben. Pada waktu yang bersamaan, distribusi baru juga terjadi pada puncak kolom antara eluen yang baru dengan adsorben yang telah mengandung sebagian sampel.

Karena komponen-komponen sampel hanya dapat bergerak bersama eluen, maka kecepatan bergerak dari satu komponen tergantung pada lamanya komponen berada dalam eluen, dimana hal tersebut bergantung pada seberapa besar komponen tertambat pada adsorben. Pemisahan terjadi karena komponen sampel lebih banyak tertahan oleh fase diam atau terbawa oleh fase gerak, tergantung pada afinitas komponen terhadap kedua fase.

IDENTIFIKASI KOMPONEN TERPISAH

Karena kromatografi kolom hanya dapat digunakan untuk memisahkan komponen, maka identifikasi komponen terpisah dapat dilakukan dengan berbagai metode identifikasi yang lain, diantaranya adalah dengan melakukan kromatografi kertas atau KLT terhadap komponen yang terpisah, atau dapat juga dilakukan identifikasi secara spektrofotometri untuk mengetahui kadar masing-masing komponen yang terpisah.

1.       Tentukanlah satu sampel untuk dilakukan pemisahan menggunakan kromatografi kolom terbuka!
2.       Tentukan adsorben yang bisa digunakan untuk memisahkan sampel tersebut!
3.       Tentukan eluen yang bisa digunakan untuk memisahkan sampel tersebut!
4.       Buatlah diagram alir prosedur pemisahan sampel menggunakan kromatografi kolom terbuka!