Teknik Dasar Kromatografi Kertas

• PRINSIP KROMATOGRAFI KERTAS

Pernahkah Anda mengamati makanan/minuman yang Anda konsumsi? Komponen apa sajakah yang terkandung dalam makanan/minuman tersebut? Apakah makanan/minuman tersebut mengandung pewarna yang aman? Bagaimana cara mengetahui komponen pewarna yang terdapat dalam makanan/minuman yang kita konsumsi?
Kromatografi kertas merupakan metode analisis yang digunakan untuk memisahkan bahan kimia berwarna. Dengan menggunakan kromatografi kertas, kita dapat mengetahui komponen zat warna dalam suatu bahan, apakah aman untuk digunakan atau tidak, dengan cara membandingkan zat warna dalam sampel dengan zat warna standar.

Kromatografi kertas merupakan salah satu metode untuk menguji kemurnian suatu senyawa atau mengidentifikasi suatu zat, dapat digunakan untuk memisahkan suatu komponen dalam sampel, terutama komponen zat warna, berdasarkan distribusi komponen di antara fasa diam dan fasa gerak. Kromatografi kertas ini merupakan perkembangan dari sistem partisi. 

Pada kromatografi kertas, fasa diam adalah air yang disokong oleh selulosa dari kertas kromatografi. Sedangkan fasa gerak merupakan campuran dari beberapa pelarut organik dan air. Gambar komponen sampel yang dipisahkan dengan kromatografi kertas sebelum dan setelah elusi.

Gambar. 1 Komponen sampel sebelum dan setelah pemisahan

• PEMILIHAN KERTAS

Pemilihan kertas sangat berpengaruh pada pemisahan dengan kromatografi kertas karena ukuran pori-pori kertas mempengaruhi kecepatan aliran pelarut. Kertas yang digunakan diutamakan memiliki kemurnian yang tinggi dan ketebalan kertas yang merata untuk memperoleh hasil analisa yang valid. Kertas kromatografi merupakan kertas berpori dari selulosa murni, memiliki afinitas besar terhadap air dan pelarut polar lain dengan membentuk ikatan hidrogen.

Kertas-kertas yang lebih tebal biasanya digunakan untuk pemisahan pada jumlah yang besar karena dapat menampung cuplikan lebih banyak tanpa menaikkan area dari noda mula-mula. Kertas disediakan dalam bermacam-macam standar lembaran, bulatan, dan gulungan dan dalam bentuk tertentu. Kertas harus disimpan di tempat yang terhindar dari dumber uap (terutama amonia yang memiliki afinitas yang tinggi terhadap selulosa). Sebaiknya kertas tidak disimpan pada tempat-tempat yang memiliki perubahan kelembaban yang tinggi. Karakteristik dari kertas-kertas kromatografi Whatmann dapat dilihat pada berikut ini.

Tabel 1. Karakteristik dari kertas-kertas kromatografi Whatmann

Kertas yang banyak digunakan saat ini adalah kertas saring Whatmann No. 1. Meskipun demikian, kertas Whatmann jenis yang lain juga sering digunakan. Sekalipun berperan sebagai support/penyokong/penyangga, namun kertas juga memberikan efek-efek serapan yang disebabkan oleh sifat polar dari gugus-gugus hidroksil sehingga kertas memiliki afinitas besar terhadap air atau pelarut polar lain dengan membentuk ikatan hidrogen.

• PEMILIHAN ELUEN

Fase gerak pada kromatografi kertas merupakan eluen berupa campuran yang terdiri atas satu komponen organik yang utama, air, dan berbagai tambahan seperti asam-asam, basa, atau pereaksi-pereaksi kompleks untuk memperbesar kelarutan dari beberapa senyawa atau untuk mengurangi yang lainnya.

Pelarut yang digunakan adalah pelarut yang memiliki kemurnian tinggi dan mudah menguap. Pemilihan pelarut organic ini sangat penting karena akan menentukan keberhasilan pemisahan. Pemilihan pelarut disesuaikan dengan kepolaran komponen yang akan dianalisa. Pendekatan polaritas adalah yang paling sesuai untuk pemilihan pelarut. Senyawa polar akan lebih mudah terelusi oleh fase gerak yang bersifat polar dari pada fase gerak yang non polar. Sebaliknya, senyawa non polar lebih mudah terelusi oleh fase gerak non polar dari pada fase gerak yang polar. Pelarut organik yang sering digunakan sebagai fasa gerak pada kromatografi kertas diperlihatkan pada Tabel 2.

Tabel 2. Pelarut organik yang sering digunakan sebagai fasa gerak (deret eluotropik)

Tiap eluen memiliki perbandingan tertentu dalam campurannya, sehingga untuk menghasilkan campuran dengan perbandingan yang sesuai harus dibuat secara hati-hati dan teliti. Karena mudah menguap, maka eluen harus dibuat baru untuk menjamin agar komposisi dalam campurannya tetap dapat dipertahankan hingga akhir elusi. 

Senyawa organik polar akan lebih mudah larut dalam air dari pada dalam zat cair organik. Oleh karena itu, gerakan komponen akan lambat jika digunakan pelarut anhidrida, namun penambahan air dalam eluen akan menyebabkan komponen-komponen dalam sampel akan bergerak mengikuti gerakan eluen. Beberapa contoh dari macam-macam campuran eluen dapat dilihat pada Tabel 3 berikut ini.

Tabel 3. Beberapa contoh campuran eluen

• CARA KERJA KROMATOGRAFI KERTAS

Perhatikan video berikut ini untuk lebih memahami cara kerja kromatografi kertas!

Setetes larutan cuplikan yang mengandung campuran yang akan dipisahkan ditotolkan pada daerah yang telah diberi tanda di atas sepotong kertas kromatografi dimana totolan tersebut akan meluas membentuk noda yang bulat. Bila noda telah kering, kertas dimasukkan dalam bejana tertutup yang sesuai dengan satu ujung, dimana totolan ditempatkan, tercelup dalam pelarut yang telah dipilih sebagai fasa gerak. Totolan noda tidak boleh tercelup karena apabila tercelup berarti senyawa yang dipisahkan akan terlarut dari kertas.

Pelarut bergerak melalui serat-serat dari kertas oleh gaya kapiler dan menggerakkan komponen-komponen dari campuran cuplikan pada perbedaan jarak dalam arah aliran pelarut. Perlu diperhatikan bahwa permukaan dari kertas jangan sampai terlalu basah dengan pelarut karena akan menyebabkan daerah noda menjadi kabur atau bahkan tidak akan terpisah sama sekali.

Apabila permukaan pelarut telah bergerak sampai jarak yang cukup jauh atau setelah waktu yang ditentukan, maka kertas diambil dari bejana dan kedudukan dari permukaan pelarut diberi tanda dan lembaran kertas dibiarkan kering. Jika senyawa-senyawa berwarna, maka senyawa tersebut akan terlihat sebagai pita-pita atau noda-noda seperti Gambar 2.

Gambar 2. Senyawa yang terpisah sebagai pita-pita atau noda-noda pada kertas kromatogram

• TEKNIK ELUSI (PENGEMBANGAN) PADA KROMATOGRAFI KERTAS

Terdapat berbagai teknik elusi pada kromatografi kertas, yaitu:

       Kromatografi Kertas Satu Arah

  Metode Ascending (Penaikan)

Pada metode ini, eluen diletakkan di bagian bawah bejana kemudian kertas dicelupkan di atasnya. Eluen akan merambat ke atas dengan gaya kapiler dan laju perambatan yang pelan dan semakin lama akan semakin menurun karena pengaruh dari gaya berat. Namun demikian, perambatan yang pelan akan memperbesar kemungkinan untuk tercapainya kesetimbangan sehingga menghasilkan pemisahan yang baik. 

Gambar 3. Kromatografi kertas metode ascending

Metode Descending (Penurunan)

Pada metode penurunan, eluen ditempatkan di bagian atas kemudian perambatan noda dan eluen memiliki arah menuruni kertas. Rangkaian alat kromatografi kertas metode menurun dapat dilihat pada Gambar 4.

Gambar 4. Kromatografi kertas metode descending

Metode Mendatar (Radial)

Pada metode mendatar, kertas yang digunakan berbentuk bulat kemudian dibagi menggunakan pensil sejumlah totolan yang akan dibuat dilebihkan satu. Salah satu bagian tersebut kemudian dipotong menuju titik tengah kertas tetapi tidak sampai terputus. Potongan tersebut nantinya akan berfungsi sebagai sumbu untuk merambatkan eluen ke bagian tengah kertas. Garis awal rambatan yang akan diberi totolan dibuat menggunakan jangka. Rangkaian alat kromatografi kertas metode mendatar dapat dilihat pada Gambar 5.

Gambar 5. Kromatografi kertas metode mendatar

 Kromatografi Kertas Dua Arah (Dua Dimensi)

Pada metode ini, elusi dilakukan secara berturut-turut dalam dua arah yang saling tegak lurus. Kertas berbentuk persegi dan sampel ditotolkan pada salah satu sudut.terdapat dua macam eluen yang digunakan pada kromatografi kertas metode ini. Elusi pertama dilakukan dengan campuran eluen pertama. Setelah itu lembaran kertas diambil dan dikeringkan kemudian dielusi dengan eluen yang kedua, dengan posisi kertas diputar 90^o. Dengan cara ini, komponen yang tidak terpisah secra maksimal pada elusi yang pertama, akan terpisah dengan lebih baik pada elusi kedua.

Metode ini digunakan untuk memisahkan sampel dengan komponen yang banyak dan memiliki nilai Rf berdekatan antara komponen yang satu dengan yang lainnya, misalnya asam-asam amino. Kromatografi kertas dua arah diperlihatkan pada Gambar 6.

Gambar 6. Kromatografi kertas metode dua dimensi

• IDENTIFIKASI SENYAWA

Terdapat dua macam noda yang harus diidentifikasi pada kromatografi kertas, yaitu noda berwarna dan noda yang tidak berwarna. Untuk noda yang berwarna dapat diamati dan diidentifikasi secara langsung, sedangkan untuk noda yang tidak berwarna perlu diberikan perlakuan tambahan agar dapat diidentifikasi.

Noda yang tidak berwarna dapat diidentifikasi dengan cara berikut ini:

        Secara fisika

   Identifikasi noda secara fisikas dilakukan dengan melakukan pengamatan di bawah sinar UV dengan panjang gelombang yang digunakan adalah 370 nm dan 254 nm.

       Secara kimia

1.       Penyemprotan

Penyemprotan dilakukan dengan menggunakan pereaksi sehingga noda yang terdapat pada kertas menjadi berwarna. Bahan yang biasa digunakan: etanol, propanol, n-butanol, kloroform. Larutan ninhidrin digunakan untuk mendeteksi asam amino, baru memberikan warna setelah 24 jam

2.       Pencelupan

Pencelupan dilakukan dengan menggunakan pereaksi yang dimasukkan dalam bejana yang dangkal kemudian lembaran kertas dicelupkan di dalamnya. Bahan yang digunakan sama dengan bahan yang digunakan pada penyemprotan. 

Berbagai macam bahan yang dapat digunakan untuk deteksi noda secara kimia dapat dilihat pada tabel di bawah ini.

Tabel 4. Macam pereaksi warna beserta penggunaannya

• PENGOLAHAN DATA PADA KROMATOGRAFI KERTAS

Identifikasi noda-noda pada kromatogram dapat dilakukan dengan menentukan harga Rf (retardation factor) dari masing-masing noda tersebut. Nilai Rf merupakan rasio jarak tempuh suatu komponen pada kromatogram dengan jarak tempuh eluen. Nilai Rf dapat diperoleh dengan menggunakan persamaan berikut ini:

Nilai Rf dipengaruhi oleh berbagai faktor, yaitu:

1)       Pelarut

Jenis pelarut dan komposisi dari pelarut dapat mempengaruhi nilai karena akan mempengaruhi koefisien partisi

2)       Suhu

Perubahan suhu berpengaruh terhadap nilai Rf karena perubahan suhu akan menyebabkan terjadinya perubahan koefisien partisi dan kecepatan aliran

3)       Ukuran bejana

Volume bejana mempengaruhi homogenitas atmosfer sehingga mempengaruhi kecepatan penguapan dari komponen-komponen pelarut. Jika bejana besar, bisa menyebabkan perambatan menjadi lebih lama.

4)       Jenis kertas

Pori-pori kertas dan ketebalan kertas akan mempengaruhi perambatan sehingga berpengaruh terhadap nilai Rf.

5)       Sifat campuran

       Karakteristik komponen yang akan dipisahkan mempengaruhi nilai Rf sebab kelarutan dalam eluen dan partisi komponen-komponen tersebut di antara fasa tetap dan fasa gerak berbeda-beda sehingga nilai Rf dari masing-masing komponen akan berbeda pula.

• KELEBIHAN DAN KEKURANGAN KROMATOGRAFI KERTAS

Kromatografi kertas merupakan metode analisa kualitatif senyawa sederhana. Kelebihan kromatografi kertas adalah sebagai berikut:

1. Tidak diperlukan peralatan yang teliti dan mahal
2. Dapat diperoleh hasil yang baik walaupun dengan peralatan dan materi yang sederhana
3. Senyawa yang terpisah dapat dideteksi pada kertas dan diidentifikasi

Selain memiliki kelebihan-kelebihan seperti tersebut di atas, kromatografi kertas juga memiliki kekurangan-kekurangan di antaranya adalah sebagai berikut:

1. Banyaknya permasalahan menyangkut cara pemasukan fasa gerak, perambatan fasa gerak, dan penggumpalan
2. Membutuhkan waktu lama
3. Keterbatasan parameter senyawa yang diuji

• APLIKASI KROMATOGRAFI KERTAS

Kromatografi kertas banyak digunakan sebagai alat dalam penelitian dan analisa. Beberapa penerapan dari kromatografi kertas adalah sebagai berikut:

• Penemuan senyawa-senyawa dalam tanaman
• Analisa logam-logam dalam tanah
• Pemisahan alkaloid (senyawa yang mengandung substansi dasar nitrogen basa, biasanya dalam bentuk cincin heterosiklik, banyak terdapat pada tanaman)
• Pemisahan asam lemak
• Analisa bahan tambahan makanan pada makanan dan AMDK 
• Pengujian rutin urine dan cairan-cairan lainnya yang mengandung asam-asam amino dan gula (untuk diagnosa suatu penyakit)

1. Tentukan tahapan prosedur analisa zat warna sintetik pada produk pangan (yang sudah Anda tentukan pada Kegiatan Belajar 2) dengan kromatografi kertas!
2. Tentukan alat dan bahan yang diperlukan untuk analisa!
3. Sebutkan data-data yang diperoleh dari kromatografi kertas dan jelaskan cara mengolah data tersebut!